Bicyclic RGD peptides : Novel high-affinity ligands for selective integrin-binding and integrin-mediated cell adhesion
Bernhagen, Dominik; Möller, Martin (Thesis advisor); Timmerman, Peter (Thesis advisor)
Aachen (2019, 2020)
Doktorarbeit
Dissertation, RWTH Aachen University, 2019
Kurzfassung
In dieser Arbeit werden bizyklische Arg-Gly-Asp (RGD)-Peptide als neuartige selektive und hochaffine Integrin-Liganden beschrieben, die für die Visualisierung von Membran-Integrinen und Integrin-vermittelte Zelladhäsion in 2D und 3D Polymermatrices verwendet werden können. Für das affinitätsbasierte Screening und die Auswahl hunderter potenzieller RGD-Bizyklen gemäß ihrer Bindung an Integrinavb3, avb5 und a5b1 wurde eine schnelle und kosteneffiziente ELISA-Methode entwickelt, die ein hochaffines, biotinyliertes und gefaltetes Peptid (‘knottin-RGD’)als Benchmark-Liganden verwendet. Nach Screening und Optimierung der avb3-, avb5- und a5b1-Affinität und -Selektivität der bizyklischen RGD-Peptid-Bibliotheken, die das RGD-Motif in einem Ring und ein willkürliches XXX-Motif in dem zweiten Ring aufweisen, wurden drei hochaffine und hochselektive avb3-Liganden (CT3HPQcT3RGDcT3, CT3HPQCT3RGDcT3,CT3HSQCT3RGDcT3; IC50: 30-42 nM), ein semi-affines und nicht selektivesavb5-bindendes Peptid (CT3RGDcT3NWaCT3; IC50: 650 nM) und drei hochaffine und semi-selektive a5b1-Liganden (CT3RGDcT3AY(D-Leu)CT3, CT3RGDcT3AWGCT3,CT3RGDcT3AYaCT3; IC50: 90-173 nM) ermittelt. Weiterhin wurden ausgewählte avb3- und a5b1-bindende Peptide durch Oberflächenplasmonenresonanz verbesserte Fluoreszenzspektroskopie (SPFS) und 2D NMR Spektroskopie charakterisiert. Die Integrin-Färbung auf Zellmembranen mithilfe fluoreszenz-modifizierter RGD Bizyklen, analysiert durch konfokale Mikroskopie, offenbarte hohe Färbungslevels für "Adipose-derived" Stammzellen bei Anwendung des a5b1-selektiven bizyklischen Peptids CT3RGDcT3AWGCT3, wohingegen die effizienteste Färbung von HT29-Zellmembranen bei Anwendung des avb3-selektiven Bizyklus CT3HPQcT3RGDcT3beobachtet wurde. Ebenso wurden avb3- und a5b1-selektive Bizyklen kovalent an Elastin-ähnliche Rekombinamere (ELR) und Polyisocyanopeptid (PIC)-Hydrogele gebunden, um die 2D- und 3D-Zelladhäsion und -proliferation dieser Materialien zu untersuchen. Sowohl avb3- als auch a5b1-selektive Bizyklen förderten Adhäsion und Proliferation von Endothelzellen (HUVEC) auf 2D-ELR-Oberflächen mit deutlich höherer Effektivität als die lineare Benchmark GRGDS und mit mindestens gleichwertiger oder sogar höherer Effektivität verglichen mit den monozyklischen bzw. ‘knottin-RGD’ Benchmarks. In 3D-PIC-Hydrogelen förderte das a5b1-selektive bizyklische PeptidCT3RGDcT3AWGCT3 schon nach einem Tag die Zelladhäsion und die Formation zahlreicher Auswüchse in überlegener Art und Weise verglichen mit den Hydrogelen, die mit linearen, monozyklischen ([RGDfK]) oder ‘knottin-RGD’-Benchmarks funktionalisiert wurden. Insgesamt deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass bizyklische RGD Peptide eine gänzlich neuartige und nützliche Plattform darstellen, die ein hohes Potenzial sowohl für die Entwicklung neuer Biomarker für Zellintegrin-Rezeptoren als auch für Zelladhäsion-fördernde Komponenten aufweist.
Identifikationsnummern
- DOI: 10.18154/RWTH-2019-09912
- RWTH PUBLICATIONS: RWTH-2019-09912