Influence of laminar shear stress on transmembrane chemokines and proteases of the ADAM family in endothelial cells

Babendreyer, Aaron; Ludwig, Andreas (Thesis advisor); Zenke, Martin (Thesis advisor); Fabry, Marlies (Thesis advisor)

Aachen (2018)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2018

Kurzfassung

Die durch den Blutfluss erzeugte Schubspannung wird von Endothelzellen wahrgenommen und beeinflusst die Integrität sowie den entzündlichen Status des Endothels. Dies beinhaltet transkriptionelle und post-transkriptionelle Regulationsmechanismen. Physiologischer Blutfluss hat einen schützenden Effekt auf das Endothel, während pathologisch reduzierter Blutfluss die endotheliale Integrität schädigt und so die Entstehung vaskulärer entzündlicher Läsionen fördert. Das transmembrane Chemokin CX3CL1 ist einer der Faktoren, die zur Bildung dieser vaskulärer entzündlicher Läsionen beitragen. Diesen Effekt kann CX3CL1 einerseits als Adhäsionsmolekül auf der Zelloberfläche, aber andererseits auch als lösliches Chemoattraktant für monozytäre Zellen, vermitteln. Lösliches CX3CL1 entsteht durch die Prozessierung von CX3CL1 durch Metalloproteinasen der ADAM Familie. ADAMs können eine Vielzahl von Signalmolekülen, zu denen auch CX3CL1 gehört, auf der Zelloberfläche von Endothelzellen schneiden. Auf diese Weise regulieren ADAMs eine Vielzahl von endothelialen Prozessen, wie Überlebensfähigkeit oder Entzündungsantwort. Das Ziel dieser Doktorarbeit bestand darin, zu untersuchen, ob transmembrane Chemokine und Proteasen der ADAM Familie durch Schubspannung reguliert werden und so an der Beeinflussung der endothelialen Funktionen beteiligt sind. Aus diesem Grund wurde ein System zur Kultivierung von primären Endothelzellen aus verschiedenen Gefäßbetten unter Fluss etabliert. Das System wurde zu Beginn validiert, indem eine Hochregulation der endothelialen NO-Synthase und des Krüppel-ähnlichen Faktors 2 bestätigt werden konnte. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass physiologische Schubspannung sowohl die basale, als auch die TNF-induzierte Expression des transmembranen Chemokins CX3CL1 supprimierte. Dies führte zu einer reduzierten Oberflächenexpression von CX3CL1 auf unter Fluss kultivierten Endothelzellen. Adhäsionsversuche mit monozytären Zellen, die den CX3CL1-Rezeptor CX3CR1 tragen, zeigten, dass die reduzierte CX3CL1-Expression auf Endothelzellen zu einer verminderten Monozytenadhäsion auf unter physiologischem Fluss kultivierten Endothelzellen beiträgt. Eine zusätzlich durchgeführte transkriptomische Analyse zeigte, dass mehrere Proteasen aus der ADAM Familie durch Flussbedingungen reguliert werden. Von besonderer Bedeutung war hier die erhöhte Expression von ADAM15 und ADAM17 unter physiologischen Flussbedingungen. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, das die Induktion der ADAM15-Expression wird durch Schubspannungen über den Transkriptionsfaktor KLF2 vermittelt, was durch pharmakologische Manipulation, lentivirale Überexpression und siRNA-vermittelten knockdown der KLF2-Expression gezeigt werden konnte. Durch shRNA-vermittelten knockdown von ADAM15 konnte der Nachweis erbracht werden, dass ADAM15 zu einer gesteigerten Überlebensfähigkeit der Endothelzellen beiträgt. Für ADAM17 zeigte sich ein komplexerer Regulationsmechanismus. ADAM17 wird nicht nur transkriptionell reguliert, sondern insbesondere post-transkriptionell auf Ebene der Reifung. Vermittelt wird dies durch die transkriptionelle Regulation von iRhoms. Während die mRNA-Expression von iRhom1 bevorzugt durch Schubspannung über KLF2 induziert wird, wird iRhom2 hauptsächlich durch den entzündlichen Stimulus TNF induziert. Dies führte zu einer verstärkten Oberflächenexpression von ADAM17 sowohl bei physiologischen Flussbedingungen, als auch bei entzündlichen Bedingungen, wie der Stimulation mit TNF. Abschließend wurde eine Mikrofluidikkammer entwickelt, die es erlaubt Effekte auf die endothelialen Permeabilität unter Fluss kontinuierlich über die Zeit mittels impedanzspektroskopischen Messungen zu überwachen. Diese Kammer könnte für weitere Arbeiten zur Untersuchung der Funktion von ADAMs auf die endotheliale Permeabilitätsregulation unter Fluss nützlich sein. So konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Schubspannung durch die Herunterregulation entzündlicher ADAM-Substrate, wie CX3CL1, und die KLF2-vermittelte Aufregulation von ADAM15, einen schützenden Effekt auf das Endothel hat. Außerdem wird ADAM17, was sowohl entzündliche, als auch protektive Substrate auf Endothelzellen schneidet, unter entzündlichen Bedingungen über die Induktion von iRhom2, aber auch unter Flussbedingen durch iRhom1, verstärkt auf der Zelloberfläche exprimiert. Alle diese Ergebnisse zeigen auf, dass bei in vitro-Untersuchungen von entzündlichen und schützenden Endothelzellfunktionen geeignete Flussbedingungen berücksichtigt werden müssen.