Regulation und Transport der Disintegrin und Metalloproteinasen ADAM10 und ADAM17

• Regulation and transport of the disintegrin and metalloproteinases ADAM10 and ADAM17

Groth, Esther; Ludwig, Andreas (Thesis advisor); Fabry, Marlies (Thesis advisor); Pradel, Gabriele (Thesis advisor)

Aachen (2016)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen, 2016

Kurzfassung

Die Disintegrin und Metalloproteinasen ADAM10 und ADAM17 vermitteln das Ektodomänen-Shedding vieler verschiedener membrangebundener Oberflächenproteine, wie z. B. Wachstumsfaktoren, Chemokine, Zytokine, Adhäsionsmoleküle und Rezeptoren und stehen damit im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten wie Alzheimer, Asthma, Herz-Kreislauferkrankungen, Krebs und Entzündungen. Zudem haben sie einen wichtigen regulatorischen Einfluss auf die Embryogenese und Entwicklung eines Organismus. Ihre eigene Regulation unterliegt dabei Mechanismen wie der Regulation auf Genebene, Konformationsänderungen ihrer Domänenstruktur, intrazellulärer Reifung und Transport der Proteasen, Lokalisationsveränderungen innerhalb der Membran oder einer Interaktion mit Adapterproteinen. Trotz vieler Untersuchungen in diesem Bereich ist die Regulation der Proteasen noch nicht vollkommen verstanden. Insbesondere ist noch wenig über ihre Regulation an der Zelloberfläche bekannt.In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Stimulus-abhängigen Oberflächenregulation von ADAM10 und -17 auf humanen alveolaren Tumorepithelzellen der Linie A549 durchgeführt. Es zeigte sich, dass ADAM10 durch die in dieser Arbeit verwendeten Stimuli IFNγ/TNFα, LPS, Bleomycin und PMA wenig an der Oberfläche reguliert wird, hingegen die Stimulation mit IFNγ/TNFα und Bleomycin bei ADAM17 zu einer Aufregulation führte. Auffällig war vor allem eine starke Reduktion der reifen Form von ADAM17 an der Zelloberfläche nach PMA-Stimulation. Diese steht im Gegensatz zu einer stark aufregulierten Genexpression, die sich auch im Zelllysat durch eine Anreicherung der Pro-Form von ADAM17 widerspiegelte. Trotz der Herabregulation der proteolytisch aktiven Form von ADAM17 wurde seine Aktivität deutlich gesteigert, wie in dieser Arbeit durch das Shedding der ADAM17-Substrate Syndekan-1 und -4 bestätigt werden konnte. Ein leichter Einfluss von Metalloproteinasen sowie ERK1/2 auf die Oberflächenregulation von ADAM17 wurde in diesem Zusammenhang beobachtet, jedoch konnte mit entsprechenden Inhibitoren für Metalloproteinasen bzw. ERK1/2 die Herabregulation der Oberflächenexpression von ADAM17 nicht vollständig aufgehoben werden. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass die Stimulation mit PMA nicht nur mit einer länger anhaltenden Abnahme von ADAM17 auf der Zelloberfläche, sondern auch mit einer Freisetzung von ADAM17 in Exosomen einhergeht. Die isolierten Vesikel beinhalteten neben der reifen Form von ADAM17 die exosomalen Marker CD9, CD63, Hsp70 und Flotillin-1 und wiesen eine Dichte zwischen 1,12 und 1,14 g/ml im Saccharose-Gradienten auf, sodass es sich sehr wahrscheinlich um Exosomen handelt. Zudem konnte α5-Integrin verstärkt nach Stimulation in den Exosomen nachgewiesen werden. Neben der PMA-Stimulation führte auch eine Stimulation mit dem physiologischen Stimulus LPS zu einer gesteigerten ADAM17-Freisetzung in Exosomen, nicht nur in A549-Zellen, sondern auch in der monozytären Zelllinie THP-1. ADAM10 wurde in allen Fällen konstitutiv in Exosomen freigesetzt, wobei neben der reifen Form auch die Pro-Form detektiert werden konnte. Die Biogenese der ADAM17-enthaltenden Exosomen verläuft wahrscheinlich über einen Dynamin-unabhängigen Internalisierungsweg, wie mittels Inhibitoren und siRNA- bzw. shRNA-Knockdown von Dynamin nachgewiesen werden konnte. Da ADAM17 in Flotillin-haltigen Lipid-Rafts lokalisiert ist und zusammen mit Flotillin-1 in PMA-induzierten Exosomen abgegeben wird, könnte der Internalisierungsprozess von ADAM17 mit Flotillin assoziiert sein. Untersuchungen der zytoplasmatischen Domäne von ADAM17 zeigten, dass die Defizienz der Phosphorylierungsstellen Threonin 735, Serin 794 und Serin 822 keinen Einfluss auf PMA-induziertes JAM-A-Shedding und die Freisetzung von ADAM17 in Exosomen hat, jedoch scheint das Fehlen des C-Terminus die Freisetzung der Protease in Exosomen zu verhindern. Durch durchlusszytometrische Untersuchungen der PMA-induzierten Exosomen konnte nachgewiesen werden, dass ADAM10 und ADAM17 zumindest auf einem Teil der Exosomen mit dem N-Terminus nach außen orientiert sind. Obwohl die Metalloproteinase-Domäne nach außen gerichtet ist, zeigten jedoch Syndekan-Shedding-Versuche keinerlei Beitrag von ADAM17, wie mittels Knockdown von ADAM17 gezeigt wurde. Stattdessen scheint ADAM10 in diesem Fall die Spaltung der Syndekane zu übernehmen. In dieser Arbeit konnte ein neuer Regulationsmechanismus für ADAM17 aufgezeigt werden. Welche Rolle dieser unter physiologischen Bedingungen spielt, muss in weiteren Studien noch untersucht werden.

Einrichtungen

• [528500-2]
• Lehrstuhl für Makromolekulare Chemie [154610]
• Fachgruppe Chemie [150000]